l 传统手工计数方法

ELISPOT检测的最终数据是细胞频率（即在细胞群体中，受某种特异性抗原刺激而分泌某种细胞因子的阳性细胞占细胞总数的比例）。细胞总数在试验开始已经计数。需要统计的是阳性细胞（也称斑点形成细胞（spot forming cells，SFC）数目。根据以前的技术研究，科学界已形成共识，每一个ELISPOT斑点对应唯一一个阳性细胞。所以ELSPOT数据处理重要的工作就是进行斑点计数。

手工计数一般是使用双筒解剖镜，在放大25倍的解剖镜下，一个孔的底板刚好覆盖一个完整的视野。实验操作人员手持按压式的计数器，对孔内的斑点逐一计数。手工计数很大的优点就是可以利用人脑的智慧与经验：比如可以适应各种大小的斑点，排除各种假阳性的斑点，能辨认复杂背景下的模糊斑点，等等。如果实验者只是偶尔小规模的做一做ELISPOT，手工计数仍然是首选。但是手工计数也有致命的弱点。

l 手工计数效率低下、工作乏味，不能适应高通量筛选

假设一个ELISPOT孔有200个斑点（这不能算多，一个孔可以容纳上千个斑点），计数前先要定位，接着要对焦，对焦完成之后要计数至少两遍（以保证数据的可靠性）。保守估计，这样一个孔的计数与处理工作需要10分钟。那么整块板96个孔完成数据处理需要960分钟，也就是大约两个工作日。如果同时做5块板的检测，那么光是最后的数据处理就需要十个工作日，也就是两周时间！此外，手工计数工作本身的单调、机械和重复，也是常人无法长时间忍受的。

作为对比，BioReader 4000完成一个孔只需要6-7秒钟，完成一块板需要10分钟，完成五块板的数据分析并且打印出详细的结果报告也仅仅需要1小时。

l 手工计数很难保证统一的标准

我们知道，在斑点计数之前先要设定一系列的判定标准。比如斑点的形状，圆形度，边缘至中心的渐变梯度，半点的直径，斑点与背景对比度，等等。然后再应用相同的标准对所有的孔，包括实验孔与正负对照孔进行计数。这样才能给出公正客观的结果，避免出现事实上的“双重标准”。但是我们知道，人的主观性随意性很强。即使并非出于故意，在执行标准的时候，也难保自始至终能够执行统一标准而不走样。

作为对比，BioReader 4000可以设定各种参数与判定标准，这些参数与标准可以保存成单一的“方法文件”保存或者通过E-mail传递，任何时候、任何地点都能保证相同的读板标准。

l 机器计数可以获得斑点大小分布信息，手工计数做不到

从前面的1.2节我们知道，同种细胞受同种刺激物刺激，斑点大小服从正态分布。但是细胞或者刺激物任何一种改变都会导致不同种类的斑点产生，这就有可能在同一孔内出现两种或者两种以上的斑点。

为了便于说明问题，我们来看一个实际例子。如图8.1所示，这是某位乙肝病人用HBcAg刺激的ELISPOT结果。A是负对照，不加HBcAg刺激也出现了较多斑点。B是用HBcAg刺激的结果，斑点数目是增加了，但是差别不显著。如果仅仅只是斑点计数的话，如图D表格的倒数第二行所示，负对照比实验孔，斑点总数为189：380，相差只有一倍。

但是仔细对比图A、图B，我们发现，图B中似乎有两种斑点，一种是和图A相同小斑点，此外还有一些大的斑点。借助于机器，我们可以轻松获得A、B孔中的斑点直径分布图，图C。从图C我们可以知道，原来实验孔中真的有两种斑点，分别对应正态分布图中的两个峰。两个峰的分界点在100μm处。小于100μm的斑点与负对照孔相同，是非特异性斑点，属于细胞自发产生；大于100μm的斑点是特异性斑点，由HBcAg刺激产生。

由于有了充足的信息与理由，我们可以在最后斑点计数的时候，把斑点直径的阈值设定为100μm：我们只计数大于100μm的斑点，小于100μm的斑点不予计数。这样负对照孔与实验孔的最终结果为3：50，相差有17倍！这比最初相差一倍的结果显著得多。

以上的例子说明，某些场合ELISPOT图像分析仪可以提供额外的重要信息，这是手工计数完全无法做到的。 

l 机器计数可以获得细胞因子相对定量信息，手工计数做不到

我们知道，通过ELISPOT斑点计数可以提供阳性细胞频率的数据。也就是说，在给定细胞群体当中，我们可以知道有多少细胞在分泌细胞因子。但是另一方面，我们也希望知道这些细胞分泌细胞因子的相对数量。尤其是在经过某些处理的情况下，阳性细胞的频率没有变化，但是细胞的平均分泌量增加了。我们也希望ELISPOT检测能够提供这方面的数据。这种数据的获得就依赖于ELISPOT 图像分析仪的斑点光密度分析功能。手工计数是无法获得的。

那么，如何来确定每个斑点代表的细胞因子数量呢？显然斑点的面积可以作为一个度量，细胞因子分泌越多，斑点就越大。反之亦然。另外，斑点颜色深浅（也称为：光密度）也可以作为一个度量，细胞因子分泌越多，斑点颜色就越深，反之亦然。打一个简单的比方，把一个斑点比作一座山峰，斑点的面积就是山峰的占地面积，斑点的深浅就是山峰的高度，细胞因子的总量就是山峰的体积。那么经过一个简单的数学微积分处理，就可以根据每个面积单元的高度而把山峰的重体积积分出来。ELISPOT斑点光密度定量就使用的这个原理。

如图8.2所示，这是BioReader 4000光密度分析报告。它可以提供的信息有：孔的位置、每孔的斑点数目、该孔斑点的平均光密度（Average Opt. Density）、该孔斑点的总面积（Cumulated values area）、该孔相对细胞因子分泌总量（TOD，即光密度总值）。

需要指出的是，光密度分析只能提供细胞因子分泌量的相对值，而不能提供细胞因子的绝对分泌量。原因是很显然的，诸多因素都对斑点的大小和颜色的深浅有影响。所以我们只能通过同一次实验，在实验条件完全相同的情况下，比较不同细胞、不同刺激物或者不同处理带来的细胞因子分泌量的相对变化。