ELISPOT检测的是阳性细胞的频率，也就是出斑点的细胞占整个加入细胞的比例。不仅要计数斑点，也要计数孔中加入的细胞。每孔加入的细胞有一个上限，大约是60万，这是96孔板每个孔能容纳的细胞极限，超过这个极限，细胞就不再单层平铺在孔底了。而ELISPOT检测的前提条件是细胞单层平铺在孔底。

理论上说，同一次实验，孔内的斑点数量应该和加入孔中的细胞数量成正比，不论加入细胞多少，阳性细胞的频率是恒定的。正是基于这一前提，ELISPOT检测的单位被定义为，每百万细胞中阳性细胞的数目，英文SFC/Million (Spots Forming Cells per Million cells)。

但是实际情况究竟怎样呢，斑点数量真的和细胞数量成正比吗？

经过反复的实践，我们发现这条规律只有在特定的前提下才成立。这个前提就是有足够的抗原呈递细胞（APC）密度，以满足细胞间的相互作用。由于特异性的ELISPOT反应都需要APC把抗原呈递给T细胞，所以只有APC充足的时候，斑点数目才和细胞数目成正比。

通常的ELISPOT检测是不单独制备APC的，而是依靠混合在淋巴细胞中的APC担负抗原呈递的作用。好在PBMC和小鼠脾脏淋巴细胞都含有足够的APC，在特定的细胞浓度下都会发挥正常的抗原呈递功能。另外，不同的刺激物类型对APC的要求也不一样，需要具体情况具体分析。

l 非特异性刺激物

非特异性的刺激物可以直接刺激淋巴细胞，这种刺激不依赖于APC或者其它辅助细胞，是单细胞反应行为。所以它对细胞密度没有要求，在极宽的细胞浓度范围之内——多至40万/孔，低至5千/孔——斑点数量和细胞数量都有简单的正比例关系，参见图4.2。但是考虑到，只有恰当的斑点数目才便于数据统计，所以推荐细胞密度为10万/孔。如果细胞数目过多，满孔都会被斑点覆盖，并且相互重叠。

l T细胞表为肽/CEF/ICE

T细胞表位肽比较特殊。一方面，它需要APC的呈递，是双细胞反应行为；另一方面它不需要APC的加工，对于APC的依赖相对较低。以使用ICE多肽库为例，实践中我们发现在5万/孔—60万/孔的细胞浓度范围内，都可以获得很好的斑点数与细胞数的线性关系（参见图4.2）。通常我们推荐20万/孔的细胞密度。如果在这样的细胞密度下，斑点过多或者过少，可以根据实际情况，在线性范围许可的限度内减少或者增加每孔种植的细胞密度。

l 普通多肽/蛋白/组织提取物

不论是普通多肽（比如重叠多肽库）还是蛋白质或者蛋白类的组织提取物，这些刺激物都需要APC的摄取、内化、加工、呈递，之后T细胞才能被刺激。所以，使用这些刺激物的时候，一定要保证足够的细胞密度。根据我们的经验，细胞密度要至少达到20万-30万每孔。多肽推荐的细胞密度为30万/孔，蛋白推荐的细胞密度为40万/孔。也可以根据实际情况，在线性范围内调整，参见表4.1与图4.2。