l 背景知识

我们都知道，内毒素的化学本质是革兰氏阴性细菌的脂多糖。它可以激活免疫细胞的受体TLR4 (Toll like receptor4)和TLR2，从而引发免疫细胞内一系列的反应，包括产生一系列细胞因子，从而启动先天免疫应答（Poltorak, A. et. al., 1998）。

实际上，内毒素只是一大类能通过TLR受体家族激活先天免疫系统的供体中的一种。其它的供体还包括细菌共有的Lipopetide、脂蛋白（Lipoprotein）、鞭毛蛋白（Flagellin）（vison, S. M et. al., 2007）；革兰氏阴性菌的多聚甘露糖醛酸（Mannuronic acid polymer）、非典型脂多糖（Atypical lipopolysaccharide）、外膜脂蛋白A、膜孔道蛋白（Porin）、外膜蛋白A（Outer membrane protein A）、菌体糖脂质（Glycolipid）、菌毛蛋白A（CsgA）；革兰氏阳性菌的肽聚糖、磷壁酸；分枝杆菌中特有的三乙酰化脂蛋白（Triacetylated lipoprotein）、二乙酰化脂肽（Diacetylated lipopeptide）、脂阿拉伯甘露糖（Lipoarabinomannan）、结核分支杆菌的结核素（STF）；支原体的二乙酰化脂肽；锥虫的糖肌醇磷脂（Glycoinositolphospholipids），弓形虫的Profilin-like protein；真菌的酵母聚糖；病毒的未甲基化CpG DNA、 ssRNA、 dsRNA，某些病毒的膜蛋白与膜融合蛋白。

这些外源病原性的供体刺激TLR受体家族之后，共有4条信号通路，包括：1依赖于MyD88（骨髓分化基因）信号通路，这是主要通路；2不依赖于MyD88信号通路；3Small GTPase信号通路；4PIP信号通路。四条通路也相互偶联成网，激活后面的效应途径，包括有丝分裂原激活的蛋白激酶途径（mitogen-activated protein kinase, MAPK）和NF-κB途径等等（Oda, K et. al., 2006）。

一旦这些非特异性细胞免疫途径激活，作为检测特异性细胞免疫的ELISPOT检测必然会受到干扰。届时，我们将无法区别哪些斑点是特异性抗原刺激产生的，哪些是非特异性的细胞免疫反应产生的。所以，增加ELISPOT检测可信度，提高检测重复性的一个重要环节就是要严格控制好以内毒素为首的可能干扰ELISPOT检测的各种TLR供体。

l 应对措施

实际实验中，最容易出现的TLR供体干扰来源是微生物的污染，包括细菌、真菌和酵母。为了尽可能避免内毒素对实验结果产生的干扰，重点要做好以下几个方面：

 1选择高品质的ELISPOT试剂盒，试剂盒内的成分应该尽量完整。我们推荐达科为/U-Cytech公司的产品。该产品的质量已为国内客户多年的使用所证实，并且试剂盒内的各种成分非常齐备，除客户必须自备的Milli Q和PBS之外，客户不需要自行准备其它试剂，避免了引入各种TLR供体而干扰实验。

作为对比，BD公司和Diaclone公司的ELISPOT试剂需要客户自行准备封闭液以及抗体稀释液，Mabtech公司更是只提供抗体对。特别指出：自行准备的封闭液，封闭之后会直接接触检测细胞，引入受污染的微生物或者内毒素是很普遍的。这就会导致背景变脏，负对照产生额外的斑点，并且实验孔中特异性的斑点与非特异性的斑点混杂，最终影响整个实验的重复性与可信度。

ELISPOT检测中，无菌操作部分需要的各种溶液应该在洁净的空间内（比如超净台内）配制，尽量采用过滤除菌的方式。以未包被ELISPOT试剂为例，需要保持严格洁净的溶液有：润湿PVDF膜的酒精、洗涤用超纯水或者PBS、包被抗体以及抗体稀释液、封闭液、培养基、刺激物。

在洁净的空间内配制可以有效避免灰尘以及其它污染物。采用过滤除菌可以有效滤除菌体，如果用高压灭菌，容易引起生物活性成分失活，而且死亡的菌体反而会释放出更多的TLR供体成分。

使用无内毒素的各种耗材、器皿。有些实验室习惯于使用一次性塑料耗材培养细胞或者做实验，这些耗材确实使用方便，并且能避免污染。但对于ELISPOT检测而言，最好选用已经表明不含热源的品牌。如果使用可重复使用的玻璃器皿，注意严格浸泡洗液，严格清洗。内毒素或者某些TLR供体的化学性质非常稳定，只有在浓硫酸/重铬酸钾的洗液中或者170°C烘烤4小时才会完全分解。

使用高质量的刺激物。

使用达优®无血清培养基。

严格的无菌操作。

总之，内毒素以及其它TLR供体是ELISPOT检测中一大类干扰源。它们并不会导致ELISPOT检测的完全失败，故初学者这些干扰源不会太在意。但是要获得高质量的检测结果，增加实验的可信度与重复性，一个进阶的实验者必须考虑这些问题了。