1. 细胞冻存复苏技术简介

在ELISPOT检测的应用中，往往需要用到冻存的淋巴细胞样品作为检测细胞。由于ELISPOT检测的是细胞的免疫功能，不仅仅需要保持细胞的存活率，而且还要保证细胞的功能不发生变化。传统的细胞冻存方法通常是为了保存细胞株，对细胞存活率的要求不高，更没考虑保持细胞原有的免疫状态，所以传统的细胞冻存方法已经不能满足ELISPOT检测的要求。参见图7.1。

考虑到ELISPOT检测的特殊性，荷兰U-CyTech公司经过精心的研究与反复的验证，推出了Cryostar™冻存试剂盒，在冻存液中添加了一系列对细胞有特殊保护作用的保护剂。达科为公司在接到Cryostar™冻存试剂盒之后，在我们的实验室以及国内数家客户的实验室做了细胞冻存与复苏的实验，并且对复苏之后的细胞做了ELISPOT检测。结果表明，淋巴细胞的存活率超过90%，ELISPOT斑点形成频率与新鲜细胞完全相同。参见图6.1。

2005年底，在达科为公司与中国生物制品检定所合作制备冻存的质控细胞库时，Cryostar™2005年底，在达科为公司与中国生物制品检定所合作制备冻存的质控细胞库时，Cryostar™冻存试剂盒与本文的冻存复苏技术经受住了严格的考验，细胞存活率达到95%。这表明，该项技术已经完全成熟，可以用于建立大型冻存细胞库（108-109cells）。

冻存试剂盒与本文的冻存复苏技术经受住了严格的考验，细胞存活率达到95%。这表明，该项技术已经完全成熟，可以用于建立大型冻存细胞库（108-109cells）。

根据我们的实验经验，完美的细胞冻存效果需要优质的冻存试剂盒加上严格规范的实验操作。二者缺一不可，不可偏颇，千万不要因为有了好的试剂盒而放松对实验操作的要求。为了帮助国内的客户解决好细胞冻存的问题，达科为公司以Cryostar™ 冻存试剂盒使用说明为例特此编撰这份详细的细胞冻存、复苏实验操作手册，仅供参考。

Cryostar™冻存试剂盒（货号UH-F1002-050）的内容如下：

    ² Cryostar™ 重悬液(Cryostar™ Resuspension Medium)，1瓶，液体，25ml。-20 °C长期保存，一旦开始使用，放置于4°C冰箱。

    ² Cryostar™ 2×冻存液(Cryostar™ 2× Freezing Medium)，1瓶，液体，25ml，-20 °C长期保存，一旦开始使用，放置于4°C冰箱。

    ² 英文原装操作手册一本；中文详细操作手册一本。

2. 细胞冻存、复苏的标准程序

l 实验仪器：

    ² 可控温度细胞离心机离心机；

    ² 血球计数板或者自动细胞计数设备； 

    ² 细胞程序降温盒Nalgene “Mr. Frosty”；

    ² -70°C冰箱；

    ² 液氮罐；

    ² 37°C水浴锅。

l 耗材准备

    ² 15ml圆锥底聚丙烯（PP）离心管； 

    ² 无菌的细胞冻存管，2ml，外螺旋；

l 试剂配制

    ² 热失活补体胎牛血清； 

    ² R0培养基：RPMI-1640培养基，含谷氨酰胺，加入1%双抗，不加血清。

    ² 达优®无血清培养基：已经含有谷氨酰胺和双抗，打开即用。

    ² Cryostar™重悬液(Cryostar™ Resuspension Medium)：含有细胞冻存保护成分，-20°C长期保存，4°C可以保存6个月。

    ² Cryostar™ 2×冻存液（Cryostar™ Freezing Medium）：含有细胞冻存保护成分以及DMSO，-20°C长期保存，4°C可以保存6个月。

    ² 台盼蓝

l 细胞冻存程序

1. 将备用细胞冻存管做上详细记号。细胞冻存管、细胞冻存盒、Cryostar™ 重悬液、Cryostar™ 2×冻存液放入4 oC热平衡。

2. 对要冻存细胞进行计数，然后4 oC，400g离心10 min。

3. （冰上操作）弃上清，根据细胞计数结果加入4 oC的Cryostar™ 重悬液重悬，使细胞浓度调整到两倍的冻存浓度（比如想要冻存的细胞浓度为：1×107 cells/ml，就用重悬液将细胞浓度调整到2×107/ml），然后将细胞吹打均匀。

注意：重悬液不含有DMSO，所以这一步动作可以稍微剧烈。

4. （冰上操作）然后逐滴加入等体积冰浴的Cryostar™ 2×冻存液，（细胞浓度变为1×107 cells/ml）。

注意：一定要逐滴加入，避免溶液中DMSO浓度的剧烈变化，详见后面的说明。

5. （冰上操作）以每只1ml细胞悬液的量分装入在-20oC热平衡过的冻存管，然后将冻存管的盖子拧严实。否则液氮会渗漏进来。

6. 立即将冻存管放入已在4oC热平衡的冻存盒(“Mr. Frosty”)，然后将冻存盒放入-70oC冰箱内。也可以将冻存管放于程序降温仪中，以1oC/min的速率降温到–70oC。

7. 24hr后，把-70oC保存的冻存管转移到液氮中。

8. 将细胞在液氮罐中冻存位置记录在实验室的液氮设备管理单上。

l 细胞复苏程序

1.血清、R0培养基需要在4oC热平衡，Lympho-Spot™无血清培养基需要37oC热平衡。15ml离心管需要4oC热平衡。水浴锅要预先调到37oC。

2.用夹子将细胞冻存管从液氮中取出。如果有液氮渗漏到冻存管中，要稍微拧开管盖，让气化的液氮逃逸。

警告：据报道，有些冻存管在解冻时会发生爆炸，为了消除这种危险，建议实验中只使用牢固的聚乙烯冻存管用于液氮保存。

3.用夹子持住冻存管，浸入37ºC水浴锅内。轻轻晃动冻存管，注意管内冻存细胞的融化情况。当管内的冰核还有黄豆大小的时候，取出来，转移到超净工作台内。用酒精棉擦拭管口，然后将冻存管插于碎冰之上。

注意：这一步对细胞存活率至关重要。既要尽快融化，以减少融化过程对细胞的损害；又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间，以减少DMSO对细胞的毒害。切不可将冻存管放在在烧杯内不管。

4.（冰上操作）用移液枪取1ml胎牛血清(4ºC)，枪头插到冻存管管底，缓慢地加入这一毫升血清。

5.（冰上操作）温柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移到一个预冷的15ml离心管内。然后，用移液枪取1mlR0培养基(4ºC)，枪头插到离心管管底，缓慢地加入这一毫升培养基。然后换枪头再重复两次，一共向离心管管底加入3ml的R0培养基。

6. 盖上离心管管盖，轻轻上下颠倒混匀。然后缓慢的补加R0培养基到14ml，此时不再需要从管底加入了。补加满，然后盖上管盖，轻轻的上下颠倒混匀。

7. 4ºC，400g离心10min，弃上清，加入1ml Lympho-Spot™无血清培养基，混合均匀。

8.（优化步骤，可以略过）如果细胞有成团现象，这是由于死亡细胞释放出来的DNA缠绕所致。可以加入0.1ml DNase(1mg/ml)，37 ºC孵育10min。

9. 取20μl细胞悬液，台盼蓝活细胞计数，计算存活率（viability）。

       根据计数结果，补加Lympho-Spot™无血清培养基至所需要的细胞浓度，进行ELISPOT检测。