拿什么拯救您的细胞稳转实验？是时候展现真正的技术了

一般来说，外源基因导入动物细胞可分为瞬时转染和稳定转染。瞬时转染导入的DNA仅能在动物细胞中维持数天，稳定转染导入的DNA能整合进动物细胞基因组中，随后细胞经过分裂增殖形成稳定表达转染基因的细胞系。在转染的基因表达质粒（或共转质粒）上添加选择标记，是筛选稳定转染细胞的最常用方法之一。

想要做好稳转，掌握下列几项妥妥的没问题~

一、选择稳转质粒

需要含有选择标记（例如抗生素抗性基因）的基因表达质粒，选择标记可以位于基因表达质粒上，或者位于共转染的单独的质粒上。阴性对照应使用不含选择标记的基因表达质粒转染细胞。 

二、稳转之前 

• 确保使用的细胞系可以从分离的细胞中产生克隆，因为一些细胞需要互相接触才能生长；

• 选择合适的筛选标记；

• 选择适合您细胞类型的转染方法；

• 通过建立剂量-反应曲线（杀伤曲线）确定细胞类型的筛选条件（Ausubel等，1995）。

三、杀伤曲线建立

最适浓度通过建立细胞杀伤曲线来确定。每种真核细胞系对不同抗生素的敏感度不同(某些细胞系能够完全抵抗某种抗当素)，针对每种用于稳定转染的新细胞系或细胞株，杀死未转染细胞所需的最适浓度必须通过实验来确定。

(*应为每种细胞类型建立杀伤曲线，并且每次使用新批次的选择性抗生素)

遗传霉素（Geneticin, G418）是一种氨基糖甙抗生素，是稳定转染常用的筛选抗生素之一。哺乳动物细胞的筛选浓度根据细胞类型等多种因素而变化，以InvivoGen的G418为例（不同厂家不同批次产品溶解度各有差异，仅供参考）。在开始实验前，建议通过测试几种浓度（100 μg/ ml至1 mg / ml）来确定杀死宿主细胞系所需的最佳抗生素浓度。

InvivoGen建议的工作浓度：G418通常以400 μg/ ml的浓度使用。当然仍需要为您的细胞确定最佳浓度。下面列出了常见哺乳动物细胞使用G418筛选的浓度（参见下表）。

好不容易get到了实验技巧，奈何无机会试手？

小达君在开学/开工之际为大家准备了InvivoGen的筛选抗生素G418免费试用装

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试用装规格：1ml G418溶液 (浓度：100mg/ml)

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InvivoGen G418产品特点

产品浓度：100 mg/ml （in HEPES buffer）

CAS number：108321-42-2

质控：每批产品都经过全面测试，以确保不存在批次差异

纯度：≥90％（HPLC）

内毒素水平：<0.5 EU / mg

细胞测试：在G418敏感和G418抗性哺乳动物细胞系中验证产品效果

产品信息

InvivoGen 1977年成立于法国，是法国最早的生物科技公司。公司成立的初期阶段主要提供细胞培养相关试剂，如抗支原体、细菌、真菌污染的抗生素以及基因筛选抗生素（Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin）。随着天然免疫研究热点的兴起，InvivoGen于2000年开始致力于天然免疫相关产品的研发和生产，并成为全世界最优质、最专业的天然免疫相关产品生产商。InvivoGen为天然免疫研究提供一整套研究方案，包括不断更新的模式识别受体（PRRs）激动剂和拮抗剂，PRRs报告基因细胞以及天然免疫信号通路的诱导剂和抑制剂等。