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ELISPOT Part 4---- ELISPOT关于细胞处理相关问题介绍
一、细胞处理
接下来，我们会从细胞的来源，如何培养，以及使用的培养基等几个方面详细的给大家介绍一下细胞样本是如何处理的。
1. ELISpot 和 FluoroSpot适用于多种细胞类型
细胞可以来源于各种来源以及不同的物种。比如培养的细胞系、人的全血或小鼠的脾脏。来自于粘膜组织的细胞也能应用于ELISpot。同时来源于不同物种的静脉血和脾脏细胞也可用于ELISpot，例如猴子、小鼠、大鼠、牛、马、羊、猪等。
2. 较常用的细胞--外周血单个核细胞（PBMC）
我们可以很容易地通过密度梯度离心法从血液中获得外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC）。提取出来的PBMC可以直接使用，也可以被冻存，用于以后的ELISpot/FluoroSpot实验。对于人来源的PBMC样本，血液样本中应该加入柠檬酸钠抗凝或者直接使用肝素抗凝管收集。
3. 细胞的质量是影响实验结果至关重要的因素
在活细胞中，细胞凋亡的比例都不高，能够正常的分泌蛋白质，不会对实验结果产生影响。细胞处理过程的标准化对于成功的细胞检测是至关重要的，特别是对于ELISPOT/FLUOROSPOT实验。从血液样本中提取出来的PBMC，超过3小时就可能被活化的粒细胞污染，进而影响实验结果。
解决这一问题的三种方法：
①在保存过程中轻轻搅拌血液样品；
②在保存样本前，用PBS或RPMI1:1稀释血液样本；
③在检测前去除血液样本中的粒细胞。
4. 实验中可以使用冻存的细胞
在 ELISPOT 检测的应用中，往往需要用到冻存的淋巴细胞样品作为检测细胞。由于 ELISPOT检测的是细胞的免疫功能，不仅仅需要保持细胞的存活率，而且还要保证细胞的功能不发生变化。传统的细胞冻存方法通常是为了保存细胞株，对细胞存活率的要求不高，更没考虑保持细胞原有的免疫状态，所以传统的细胞冻存方法已经不能满足 ELISPOT 检测的要求。
5. 细胞复苏
细胞冻存和复苏都会导致不同数量的细胞死亡，这在我们复苏后并不能马上观察到。我们建议复苏后的细胞在37°C新鲜的培养基中放置1小时或更长时间。 这样细胞碎片就可以很容易地被去除，并提高了检测性能。
二、ELISpot和FluoroSpot的血清和培养基
细胞培养环境能够影响我们的实验结果，其中培养基起着至关重要的作用。请考虑以下方面，以产生高效的细胞培养物。
1. 培养基
用于ELISpot和FluoroSpot的细胞培养基应与待测细胞相容。 RPMI培养基常与血清一起使用。如果在细胞培养过程中CO2受到限制，可以加入HEPES以维持细胞培养的pH值。通常推荐使用青霉素和链霉素等抗生素来降低污染的风险。
2. 血清
我们应选择一些既可以支持细胞培养，同时背景值又比较低的一些血清。并且血清本身不应引起非特异性的细胞活化或蛋白分泌。我们建议使用胎牛血清。血清批次间可能会有所不同，在ELISpot和FluoroSpot实验前我们最好测试一下新的批次。我们一般推荐血清热灭活。不推荐人血清，因为它可能含有能干扰检测的异嗜性抗体或固有分析物。
3. 无血清培养基---消除血清中不确定成份的影响
含替代血清成分从而提高细胞培养和实验结果的重复性：
▲维持淋巴细胞存活，保持细胞活力和免疫功能状态
▲不会额外刺激阴性细胞产生额外产生任何一种细胞因子
▲不会抑制阳性细胞分泌各种因子
产品优势：
▲成分固定，彻底消除了批次间的差异。
▲不含杂蛋白，背景更弱，斑点更清晰。
▲不含抑制细胞因子分泌成分，斑点更多，更加反映真实的结果。
三、细胞稀释指南
1. 活细胞计数
用台盼蓝或细胞计数仪检测活细胞的数量。评估凋亡细胞的数量是一个优势。
2. 计算需要的细胞数
计算所需的细胞数量和所需的体积。建议制备过量的细胞悬浮液（10-20%），以确保有足够的体积用于实验。
3. 加入适量的培养基
将培养基加入到细胞悬浮液中。用于T细胞检测的细胞浓度通常在0.5×106/ml和3×106/ml之间。
4. 混匀
充分混匀细胞悬液。
5. 将细胞悬浮液移到孔板中
在向孔板中加入细胞之前，应该先添加刺激物。另一种方法是将细胞和刺激物充分混匀后再加到孔板中。将细胞悬浮液移到孔板中。如果同时操作一个以上的孔板，应在加入细胞悬液前在重新混匀一下细胞悬液。一个孔板大约需要12ml。
建议稀释的步骤:
四、细胞孵育
1. 细胞数
每个孔中细胞的数量必须与细胞类型和细胞分泌的频率相适应。如果频率非常低，例如在10000个细胞中有1个，那么我们就需要更多数量的细胞，通常有250000个细胞/孔。当频率较高时，例如在10个细胞中就有1个，那么我们仅需要大约5000个细胞/孔就足够了。
2. 测定细胞线性度
在分析中，如果发现细胞没有成线性关系，可能是由于细胞数量不够，或者细胞刺激不够造成的。比如当分析抗原特异性T细胞时，PBMC细胞数不应低于每孔200000个细胞。
3. 激活
在加入细胞之前，应将刺激物添加到孔板中，或者刺激物与细胞混匀后一起加入到孔板中。细胞被添加到孔板中后就不能再添加更多的培养基，因为后加入的培养基会使细胞向边缘周围扩散。在ELISPOT/FLUPOSBOT读板前，应清洗细胞以避免膜的背景染色。在B细胞ELISPOT实验中洗板是很重要的。
4. 动力学
在建立适合细胞孵育时间时，应考虑蛋白质分泌的动力学因素。某些分析物仅在刺激超过24小时后才会分泌。
5. 湿度
我们要确保足够的湿度来培养细胞。建议培养过程中用锡箔纸包裹孔板，避免蒸发。一般的建议，37°C ，5% CO2孵育细胞。
6. 静置
避免细胞在培养过程中突然移动，因为这将对斑点的形成产生不利的影响。
前三期详情请参考：
ELISpot Part 1——ELISpot原理、优势及品牌推荐
