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一种快速高通量检测转录因子活性的新方法--告别实验室苦力

作者：admin 信息来源：达科为日期：2021年08月27日打印字体：大中小

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转录因子通过与DNA结合来调节基因表达，从而控制细胞分裂、代谢、凋亡和DNA修复等重要过程。因为它们可以控制改变细胞内基因表达，所以转录因子是研究人员非常感兴趣的。研究蛋白质-DNA相互作用的科学家经常依赖于WB或电泳迁移实验(EMSAs)，这种方法基于蛋白质-DNA复合物和非复合物DNA在非变性条件下电泳迁移的相对差异，这些实验方法步骤较多，耗时较长，通常需要放射性标记的探针。基于此，Genie公司发布了一种基于96孔板比色法的实验产品，在该方法中，感兴趣的TF首先与包被在板底的含有蛋白结合共识序列的寡核苷酸结合，孵育识别TF抗体后，通过酶显色方法来确定转录因子的活性。

比色法试剂盒与传统的方法对比

从CHO-1细胞和经过PMA（可以诱导AP-1 TF的活性）处理的CHO-1细胞中获取核提取物，利用传统的凝胶迁移方法和比色法同时检测，凝胶位移分析显示TF-DNA复合物的形成，通过放射性标记的DNA迁移率的变化来证明，但确定经处理和未处理的提取液之间的带强度差异是有一定困难的（图a）。相比之下，用比色法试剂盒检测结果可发现不同处理组之间的差异非常清晰（图b）。

比色法试剂盒的应用

通过加入刺激剂或抑制剂来评价TF结合能力的差异是比色法试剂盒的一个特征。这个特点可以用于药物快速高通量的筛选。不同浓度的TNF-α激活NF-κB p65，分别用200 ng/ml TNFα和50 ng/ml TNFα处理HeLa细胞30分钟和120分钟后，制备核提取物，然后评估NF-κB TF与其共识序列结合的相对变化。在低浓度时，TNFα使NF-κB活性增加了27倍以上，而在高浓度时，TNFα使NF-κB活性增加了50倍以上(图a所示)。

同样，通过测量了COS-7细胞中缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)的激活。HIF-1α TF与肿瘤进展有关，通过泛素化途径抑制进展的治疗使其稳定。2,2-dipyridyl是一种铁螯合剂，可防止HIF-1α泛素化。用2,2-dipyridyl处理COS-7细胞17 h后，制备核提取物，然后测定HIF-1α TF与其一致序列的结合。与未处理的细胞相比，2,2-dipyridyl处理17 h后COS-7细胞的HIF-1α TF结合DNA的能力增加了3倍以上（图b）。