l ELISPOT 图像分析仪（ELISPOT Reader）发展简史

要实现这个过程的自动化，我们很容易想到显微照相技术、图像处理技术以及计算机人工智能技术。把它们综合到一起，这就是ELISPOT图像分析仪。1992年，德国莱卡公司推出了第一台ELISPOT图像分析仪。正如上世纪60年代发明的第一台计算机占地几百平方米，且性能低下一样。莱卡公司推出的第一代ELISPOT图像分析仪，仅计算机就占据一张实验台的位置，数据采集部分使用了复杂的电视摄像系统。这台仪器体积庞大，效率低下。在90年代初期，ELISPOT技术并未受到重视，因而ELISPOT图像分析仪也没有得到推广。不到一年时间，莱卡公司就放弃了这一产品。1995年，随着荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P.（Schielen P et. al., 1995）首先引入PVDF膜到ELISPOT技术中，使得ELISPOT的可靠性和简便性提高，ELISPOT技术逐渐受到重视，相应的ELISPOT文献大量涌现。众多科研工作者迫切需要能够自动读ELISPOT板的设备，因此在1995年到1997年间，出现了数家生产ELISPOT图像分析仪的厂家。

1995年出现的ELISPOT图像分析仪厂家以德国卡尔蔡司公司，德国Bio-Sys公司，美国CTL公司，和德国AID公司为代表。对于如何识别PVDF膜板上的ELISPOT斑点，这些厂家分成两派：1）德国卡尔蔡司公司和德国Bio-Sys公司。这两家生产商延续了德国莱卡公司的思路，依然采用显微摄像系统来识别ELISPOT斑点。这种思路保持了PVDF膜板的完整性，强调对每一个孔的准确定位。2)德国AID公司和美国CTL公司。由于PVDF膜板在构造上的特殊性，PVDF膜与塑料板壁之间是可撕裂的。这两家公司从而产生了新的思路：采用粘贴纸将PVDF膜粘附，再将其从塑料板壁上撕下。这样就将识别在板上的ELISPOT斑点的问题变成了识别在平面上的ELISPOT斑点的问题。而识别平面上的ELISPOT斑点可以直接以扫描仪来进行。

在上个世纪90年代中期，通过扫描来进行ELISPOT斑点的识别是一个重要的技术进步。第一，扫描相对于摄像大大提高了分析速度；第二，扫描模式直接绕过了如何定位96孔板上的每一个孔的难题；第三，在价格上扫描系统只相当于摄像系统的三分之一或者更低，从而使得大多数实验室都能够购买ELISPOT图像分析仪。但是基于扫描系统的ELISPOT图像分析仪也有其固有的缺点。首先，扫描仪的分辨率非常低，随着ELISPOT检测方法应用范围迅速扩大，某些实验中产生的ELISPOT斑点很小，扫描仪完全无法识别。虽然扫描仪本身的分辨率也在不断提高，但和显微摄像系统相比，始终要低1-2个数量级。其次，将PVDF膜板底部的PVDF膜撕下来扫描的做法是有其不妥之处：某些时候直接导致部分结果丢失，同时也不利于数据长期保存。第三，其应用受限于以膜为底的ELISPOT板，当90年代末期，ELISPOT透明塑料板出现时，这种基于扫描的ELISPOT图像分析仪在应用上大大受阻。

在ELISPOT图像分析仪的发展史上，90年代末期出现的数码技术是重要的技术进步。数码识别技术与计算机人工智能的结合使得体积小、功能强大的ELISPOT图像分析仪成为可能。当数码技术出现以后，德国AID公司和美国CTL公司迅速抛弃了其原有的基于扫描系统的ELISPOT图像分析仪，重新投向以摄像系统为基础的ELISPOT图像分析仪。在今天的ELISPOT图像分析仪市场上，ELISPOT扫描系统只剩下部分90年代的库存产品。这就是技术进步的重大力量。

由于数码识别技术的出现，始终坚持通过显微摄像识别ELISPOT斑点这一技术路线的德国卡尔蔡司公司和德国Bio-Sys公司从此一直走在ELISPOT图像分析仪市场的前端。在具体的技术路线上，两家公司又略有不同。德国卡尔蔡司公司希望突出其高精密的显微镜头，力求在成像上做到能够识别PVDF膜上的每一个小的斑点。但是其缺陷也非常明显：第一，要达到此目的，只能通过放大图像来实现，这样就不可能在一副图像上包括整个完整孔底。卡尔蔡司公司通过软件拼接的方法，将多幅放大图像拼成一幅包括大部分孔底的图像，从而实现对整个孔中的ELISPOT斑点进行计数。这样的结果是：图像出现明显的拼接痕迹，同时，在拼接缝部分的斑点识别，以及在孔边缘的斑点识别也都同时成为了亟待解决确又难以解决的问题。第二，更关键的是，由于ELISPOT实验过程涉及细胞，细胞碎片、自发分泌、非特异分泌、显色问题等多种情况，都会在PVDF膜上留下斑点或者花纹。因此，ELISPOT斑点识别的一个关键的问题是对真假斑点的识别。熟悉ELISPOT技术的实验者都有共识，一个正常的ELISPOT斑点在大小上通常不会小于20μm。因此，关注于对小的斑点都能清晰识别，在生物学上并没有太大的实际意义，反而因为增加了小斑点的识别影响了对真正的ELISPOT斑点的识别。第三，也是不可忽视的一点：卡尔蔡司公司的ELISPOT图像分析仪是市场上价格昂贵的设备，是其他厂商同类型设备的两倍以上！

l 德国ByoSys公司的Bio-Reader系列

德国Bio-Sys公司从上世纪80年代开始就致力于生物图像识别领域，在进入ELISPOT图像分析仪市场后一直以其先进的ELISPOT斑点识别技术闻名。德国Bio-Sys公司首先解决了显微摄像系统难以定位96孔板上的每一个孔的问题。其解决方法基于图像识别技术，利用板孔边壁和真正的孔底的细微差别，在机械定位的基础上，通过软件识别来进一步提高每孔的定位精度。是目前市场上所有ELISPOT图像分析仪中唯一能够完整识别整个孔底ELISPOT斑点图像的设备。在对真假斑点的分辨中，德国Bio-Sys公司除了具备完善的物理学多参数识别技术，还特别针对ELISPOT斑点形成的生物学过程，通过细胞因子显色后的“光密度”峰值积分分析方法，精确分辨真假斑点、融合斑点等复杂情况。Bioreader系列ELISPOT图像分析仪国外大多数较有经验的ELISPOT实验室推崇的特点为：专业性和参数全开放性。因为ELISPOT实验的复杂性，ELISPOT斑点形成在不同的实验条件下有非常大的差异。这就对ELISPOT图像分析仪提出了较高的要求：既要能够保证斑点计数的真实性和一致性，又要能够根据不同情况，通过实验者的判断来校正仪器对ELISPOT斑点识别的标准。要同时实现以上两个要求，唯一的办法是将仪器的所有判断标准向ELISPOT实验者开放，实现实验者和仪器的互动。在这一方面，德国Bio-Sys公司始终走在ELISPOT斑点识别领域的前列，新的Bioreader-4000型（图8.3）和Bioreader -5000（图8.4） 型在专业性和适用性方面都领先于其他厂家的设备。

l ELISPOT 图像分析仪的发展和展望

近几年，ELISPOT图像分析仪的应用在向两个方向发展。

第一， 作为斑点识别类型的仪器，ELISPOT图像分析仪在努力地开辟在其它斑点识别领域的应用。

在这个方面做的较好的是德国Bio-Sys公司的Bioreader系列。受惠于Bioreader在光源照明设计和软件参数开放两方面的优点，德国Bio-Sys公司的ELISPOT图像分析仪只需在参数上进行调整，就可以对6孔板、24孔板、96孔板等板型上的病毒斑、溶血空斑、肿瘤细胞克隆斑等实体斑点或者空斑点进行识别，大大扩展了仪器本身的应用。

第二， 对双色、多色、以及荧光FluoroSpot的识别。

随着ELISPOT技术本身的发展，研究者不再满足于现有的对单一细胞因子分泌所形成的ELISPOT斑点的识别。双色或多色ELISPOT技术就此产生。简而言之，双色或多色ELISPOT即检测同一细胞同时分泌两种或以上的细胞因子的技术。举个例子，如果以红色显色剂显示IFN-γ的分泌，以蓝色显色剂显示IL-2的分泌，在同一个孔中，就可以通过这两个显色系统分辨：有多少细胞只分泌IFN-γ（红色斑点），只分泌IL-2（蓝色斑点），和同时分泌这两种细胞因子（棕色斑点）。

但是，原理上很简单的双色或多色ELISPOT技术在实际应用中遇到了很大的困扰。这就是关于混色ELISPOT斑点的识别问题。具体到每个细胞，如果有两个显色系统同时显色：部分红色/部分蓝色，以及其间的各种组合，都会导致不同的颜色；斑点的不同显色区域，可能以红色为主，也可能以蓝色为主，无法均一定义；先分泌某种细胞因子，后分泌某种细胞因子，可能会产生覆盖等诸多问题。这些问题都导致混色ELISPOT斑点难于识别。在这个方面，目前还没有一个很好的解决办法，从而也限制了双色或多色ELISPOT技术的应用。从实际使用中来看，有少部分科研工作者在使用双色ELISPOT技术，通常为探索性的研究；而多色ELISPOT技术，几乎没有人使用。

与之相对应，ELISPOT图像分析仪在这个方面也只是具备基本的功能。大多数ELISPOT图像分析仪采用RGB（红、绿、蓝）三色定义方案来识别多色斑点。RGB三色定义方案采用固定红、绿、蓝滤镜，通过对一种颜色斑点的遮盖来识别其他所有颜色斑点。从理论上讲，在情况下多能够识别三色斑点的ELISPOT。但实际应用中，显色系统的不同实验条件会导致不同的颜色。比如：AEC显色系统从理论上为标准红色，但实际上根据实验条件的不同，其显色从橙黄到正红到紫红。其他显色系统也有类似的问题。如果两种或以上显色系统共同作用，其混色斑点的颜色千变万化，绝对不是简单用红、绿、蓝三色固定滤镜能够分辨的。如何解决这个问题，只有在颜色定义方案上下功夫，在这个方面，德国Bio-Sys公司的颜色解决方案相对较好。德国Bio-Sys公司采用HLS（色度、亮度、饱和度）这一国际新的颜色定义方案，理论上可自定义十万种以上颜色，用于滤镜识别。在针对单色显色系统和多色显色系统因各种原因导致非标准颜色的识别上相对准确。当然该系统也有其自身的不足：对于斑点与斑点之间、孔与孔之间、板与板之间的颜色变化，不能自动适应，自动调节。对于颜色自动识别，这是一个普遍的难题，目前没有一种技术能够做到。

ELISPOT技术如果需要向多细胞因子检测的方向发展，就必须解决多显色系统同时显色的问题。既然混色识别是一个难以跨越的难题，一些ELISPOT试剂生产商自然向荧光显色方向发展，这就是荧光耦联免疫斑点技术（FluoroSpot）。由于采用荧光发光标记，而不是显色剂沉淀显色，荧光耦联免疫斑点（FluoroSpot）从诞生之日起，就天然的解决了多系统同时显色的问题。同时由于荧光发射光波长具有唯一性，其颜色不因实验条件的变化而变化。FluoroSpot从2005年出现以来，在敏感性、特异性等方面已经达到或超过ELISPOT，目前更大的难题在于长期保存的问题，限制了其商业化进程。但是，FluoroSpot作为多细胞因子检测的必然发展方向，已经在ELISPOT领域的科学工作者中达到共识。与之相配合，荧光耦联免疫斑点（FluoroSpot）图像分析仪也在2005年底首先由德国Bio-Sys公司正式推出市场，并在加拿大实现全世界首台FluoroSpot图像分析仪的销售和应用。

我们可以预测，随着FluoroSpot技术的成熟和FluoroSpot图像分析仪的成熟，FluoroSpot必然逐渐取代目前的ELISPOT技术，并使得免疫斑点技术真正成为以高通量、多因子、高灵敏、和高稳定性为特征的细胞免疫检测技术。而免疫斑点图像分析仪的不断发展也大力地推动了该技术在免疫学、病毒学、肿瘤学、以及临床检测中的广泛应用。