1. ELISPOT技术的创立

  l 先驱：Don Mason

ELISPOT技术的原型起初可以追朔到1978年的牛津大学，工作于此的Don Mason教授在随后的两年研究期间，开创了一种“胶片上的斑点技术”。

他的做法如下：首先在盖玻片上包被抗原，然后把玻片放到细胞培养皿的皿底；接着在培养皿内加入B细胞，有些B细胞已经分化为浆细胞，能够大量分泌特异性的抗体，分泌出来的抗体就会和盖玻片上的抗原结合；大约3-5个小时之后，洗去玻片上的B细胞和各种杂质，然后把玻片浸入被放射性碘同位素标记的二抗溶液中孵育一小时；洗涤之后，在玻片上覆盖胶片放色自显影，一个个斑点就在胶片上显示出来了。每一个斑点就代表了一个分泌特异性抗体的浆细胞。

如果把ELISPOT技术的核心定义为：“将细胞的分泌行为通过斑点显示出来”，那么Don Mason教授这种“胶片上的斑点”已经具备了ELISPOT技术的基本特征，并且也满足“一个阳性细胞，对应一个ELISPOT斑点”这条原则。所以把英国牛津大学的Don Mason教授称为ELISPOT技术先驱丝毫不为过。

l 创立：Sedgwich与Czerkinsky

ELISPOT技术的真正创立要等到5年之后的1983年。这一年，在南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立地创立了这项技术。一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky（Czerkinsky CC et. al., 1983a）。

受当时新兴技术ELISA的启迪，Sedgwich与Czerkinsky都选取了塑料微孔板作为固相材料。这种塑料的微孔板既可以作为抗原包被的载体，也可以作为细胞孵育的场所。他们将抗原包被到微孔板的板底，然后加入B细胞孵育。在此过程中，一部分B细胞分泌的特异性的抗体与板底的抗原结合。在实验初期，他们都选择了酶标记的二抗，而非放射性同位素标记的二抗。推测也是受到了ELISA技术的启迪。

但是问题也随酶标二抗而至，当时的显色底物都是可溶的。这对于ELISA根本不是问题，因为ELISA就是要检测可溶底物的光密度。但如果ELISPOT显色底物也可以溶解的话，那么产生的斑点将随着溶液微小的扰动而消失。对此，他们不约而同地想到了把显色底物做成琼脂糖的凝胶，通过凝胶固定可溶的色素分子，从而产生斑点。

前者开创ELISPOT方法是为了研究B淋巴细胞分泌IgM抗体的情况（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）；而后者除了用于研究B淋巴细胞分泌抗体的情况（Czerkinsky CC et. al., 1983b; 1983c），还应用于大肠杆菌分泌肠毒素（Czerkinsky CC et.al., 1983a）和成纤维细胞分泌纤维连接蛋白（Czerkinsky CC et. al., 1984）的研究。虽然研究的对象不一样，但该实验技术所涉及的原理以及方法步骤和我们现在标准ELISPOT几乎完全相同。

Sedgwick论文发表的时间略早一些，Czerkinsky则发明了“ELISPOT”这个名词，由于他们的研究都是各自独立开展，所以被公认为ELISPOT技术的创立人。

这二十多年来，ELISPOT基本原理并没有什么重大变化，但技术却一直在进步，诸如：检测材料的改进，实验灵敏度与重复性的提高，实验应用领域的拓宽等。

2. ELISPOT技术的发展

l 底板材质的改进

ELISPOT技术先驱者DonMason用的固体基质是玻璃片，由于玻璃片使用不便等诸多因素的影响，致使该技术在当时并没有得到很好的推广。Sedgwich与Czerkinsky创立ELISPOT技术之后，检测底板都是使用普通的塑料板，它的蛋白吸附能力差，因此实验灵敏度有限。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA 将膜板引入ELISPOT中（Moller SA et. al., 1985），检测的也是分泌抗体的阳性B细胞。他们引入的是硝酸纤维素膜（NC膜），获得了远优于塑料板的结果。

不过硝酸纤维素（包括醋酸纤维素）也有自身的不足。由于它是天然纤维素经过人工酯化后获得的，纤维排列不规则，膜表面的平整度差，导致表面形成的斑点外形破碎，高低错落，并且边缘弥散。这就好比在粗糙的麻布上写小字，字迹就会模糊不清。另外纤维素还存在机械承受力差，化学稳定性差，不利于长时间保存等缺点。但有一点，硝酸纤维素膜不需预先用酒精润湿，所以现在BD公司还在沿用维素膜板。

1995年，荷兰Utrecht大学免疫研究所的Schielen P团队 把一种更优于硝酸纤维素膜的PVDF膜也引入了ELISPOT检测中（Schielen P et. al., 1995）。PVDF（聚偏二氟乙烯）是完全人工合成的，可以控制其纤维的长度与排列方式，从而获得几乎完美的膜结构。做过Westernblot的人都知道，PVDF膜比硝酸纤维素膜有更优异的蛋白吸附性质，更加均匀的膜结构，更加精细的显色条带分辨率，更强的机械承受力与耐化学腐蚀性能。PVDF膜上的斑点质量是纤维素膜上的斑点所无法相比的。本手册中所有的红色斑点都是使用Millipore公司PVDF板做出来的。有一点要提醒，PVDF膜本身是疏水的，需要预先用乙醇润湿。PVDF膜的引入是继硝酸纤维素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破（McCutcheon M et. al., 1997）。至今，除了BD公司还在坚持使用纤维素膜板之外，其余所有的ELISPOT试剂公司都用PVDF膜取代了纤维素膜（Weiss AJ 2005）。

塑料板被膜板取代之后，沉寂了许多年。近几年又开始兴旺起来（Ronnelid J et. al., 1997; Okamoto Y et. al., 1997）。著名的ELISPOT塑料板当数荷兰U-Cytech公司研发的透明板，已经成为了该公司的一大特色。ELISPOT塑料板的重新兴旺有两个方面的原因：一方面是技术进步，塑料材质改进后，板底吸附蛋白的能力已经比传统的塑料板有了很大提高，虽然还赶不上膜板，但已经完全达到ELISPOT实验对膜板材质的要求。更高质量的抗体也有利于塑料板获得更好的ELISPOT结果。另一方面归因于塑料板自身的优势，相对低廉的价格，简化的操作步骤，较短的实验时间都是塑料板的优势（Ronnelid J et. al., 1997）。此外对于透明板，还可以在实验中随时观察细胞的状态与密度，这对新手是很重要的。

l 检测内容的多样化

ELISPOT技术创立之初，只是用于检测B淋巴细胞分泌的抗体，包括各种类型免疫球蛋白，包被材料是特异性抗原或者抗体的抗体（Holt PG et. al., 1984；Sedgwick JD et. al., 1984）。B细胞（尤其是分化成熟之后的浆细胞）分泌抗体的量一般比较大，容易检测，即使早期ELISPOT检测的灵敏度不够高，检测大量分泌的抗体还是不成问题的（Bjorkander J et. al., 1991; Ahlfors E et. al., 1991; Holmgren J et. al., 1992a）。时至今日，ELISPOT检测还广泛地用来研究粘膜免疫中的抗体分泌情况（Holmgren J et. al., 2005）。

后来随着技术进步，ELISPOT检测灵敏度有了大幅度的提高，以至于可检测到痕量的细胞因子，因此它的主要应用就转移到检测细胞因子上（Czerkinsky C et.al,. 1988a; 1991; Hutchings PR et. al., 1989）。现在各种常见细胞因子的检测都有了商业化的试剂盒，使用起来非常方面。能商业化检测的细胞因子包括人类、小鼠、大鼠、猴子、猩猩的干扰素（IFN-γ）、白介素（IL-2，4，5，6，10，12等）、颗粒酶（Granzyme B）、肿瘤坏死因子（TNF-α）。目前全球ELISPOT试剂盒的主要供应商有：荷兰U-CyTech公司、瑞典Mabtech公司、法国Diaclone公司、美国BD Pharmingen公司和R&D公司。他们的产品各有特点，其中荷兰U-CyTech公司的产品质优价廉，在国内市场居于主导地位。

l 预包被化

在时间宝贵，追求效率的今日，预包被化是ELISPOT技术发展的必然。作为参照，我们知道ELISA技术刚刚出现的时候，ELISA试剂盒都是未包被的，需要使用者自己临时包被。但是时至今日，几乎所有的ELISA产品都实现了预包被化。预包被是ELISPOT技术成熟的标志和在更大范围内应用的前提。

如图2.1所示，预包被有着明显的技术优势。PVDF板的ELISPOT试验一共需要3天时间，采用预包被板可以节省一天的时间，当天处理细胞，当天上板检测；未包被的检测共有13步，预包被可以省掉其中的5步，并且这5部都是需要无菌操作的步骤，占整个无菌操作步骤的5/6。节省时间只是其一，由于减少了无菌操作的步骤，使得整个实验污染与出错的概率大大降低，提高了整体试验的成功率。

综上，ELISPOT预包被技术在产品中的运用可以帮助广大实验者解决诸多问题。从目前的市场反馈情况来看，该技术在推广过程中还需要一段磨砺。导致其推广受限制的原因一方面来自成熟产品的产品价格，另外一方面源自实验者的人力成本因素，在此就不详加讲述。

凭借扎实、足够的技术储备，加上和荷兰U-CyTech公司深度合作，达科为公司先后推出了Quick Spot™系列预包被ELISPOT试剂盒，并于09年底在国内率先从Millipore公司引入可拆卸PVDF膜板推出预包被可拆卸试剂盒。达科为公司预包被试剂盒产品在2013.6月将实现全面升级，升级后产品价格较之现有价格没有变动，试剂盒配备试剂除了原有的【预包被板、检测抗体、HRP酶、显色底物、洗涤浓缩液、稀释缓冲液】，更增添了阳性刺激物！