淋巴细胞（lymphocyte）是由淋巴器官（包括淋巴结、脾脏以及胸腺）产生的体积最小的白细胞。主要存在于淋巴管中循环的淋巴液中，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者，是对抗外界感染和监控体内细胞变异的一线“士兵”。淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系，按其发生迁移、表面分子和功能的不同，可分为T淋巴细胞（T细胞）、B淋巴细胞（B细胞）和自然杀伤(NK)细胞。
 

脾脏是机体重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴细胞，占全身淋巴组织总量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，从外周血液中分离大量淋巴细胞较为困难，故经常需要从其鼠脾脏中获取大量的淋巴细胞。传统淋巴细胞方法分离存在诸多不足，比如分离液本身存在细胞毒性，分离者需要自行调节分离液密度梯度，分离所得细胞活率不高、状态不好、纯度不够等。鉴于此，达科为生物公司开发了一种小鼠淋巴细胞分离液（货号7211011），本分离液具有完全化学惰性、无生物毒性的碘化物，不会结合任何已知的生物功能蛋白，不会干扰任何细胞表面膜蛋白，不抑制酶活性，不会干扰抗原抗体反应等多优势，并且能同时适用于小鼠外周血和脾脏组织中淋巴细胞的分离，分离操作十分简单（小白看一遍都能学会）。

操作步骤

1. 断颈处死小鼠，浸泡于 75% 的乙醇中。

2. 在超净台中取出小鼠脾脏。注意无菌操作。

3. 在 35mm 培养皿中放入 4mL-5mL 小鼠淋巴 细胞分离液（取用前恢复至室温并摇匀）。研 磨（研磨操作请参考图二）。

4. 把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到 15mL 离心管中，如图一（A），覆盖 500μL-1000μL 的 RPMI 1640 培养基（保持液面分界明显）， 如图一（B）。

5. 室温，水平转子 800g 离心 30min。设置较慢 的加速度和减速度，如果有十档，设为第三 档。离心结束后细胞分层如图一（C）所示。

6. 吸出淋巴细胞层，再加入 10mL RPMI 1640 培养基，颠倒洗涤。室温，250g 离心 10min 收集细胞。

7. 倾倒上清液，用培养液重悬细胞，计数。

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注意事项

大鼠脾脏淋巴细胞分离操作：因大鼠脾脏较大，只须剪取一小部分进行实验即可，研磨与分离的方法与小鼠脾脏淋巴细胞的分离 操作完全相同。

小鼠／大鼠／兔子血液中淋巴细胞分离操作：

1.新鲜采集的小鼠/大鼠/兔子抗凝血液 0.5mL-3mL 用 RPMI 1640 或 PBS 稀释一倍（血液稀释后分离 效果更佳，注意无菌操作）。

2.在 15mL 离心管中加入 3mL 淋巴细胞分离液。小心地将经过稀释的血液平铺在淋巴细胞分离液液 面上层，避免两种液体界面混合。

3.室温，水平转子 800g 离心 15min-20min。设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，设为第三档）。

4.后续步骤与小鼠脾脏淋巴细胞分离操作相同。

特别说明——关于小鼠脾脏研磨的达科为方法：

 

☆ 推荐使用尼龙网，因为尼龙网更柔韧。

☆ 推荐使用注射器活塞来研磨脾脏。

☆ 关键所在，利用尼龙网向上的反弹力来控制研磨的力度， 将细胞可能受到的机械损伤降低到最小。

注意：

1.控制研磨力度，使尼龙网保持悬空，避免在皿底上直接 研磨而造成大批细胞死亡。

2.平皿的口径不能太大，否则尼龙网不能产生有效的弹力。

3.镊子在一边夹住尼龙网，防止尼龙网在研磨过程中滑动。

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