【高分利器】同时获得单细胞mRNA和表面抗原信息，这波操作不得了

否！滚去学习！

今天小达君就带大家学习一波sao酷炫操作：同时获得单细胞mRNA和表面抗原信息。绝对是熬夜也要学会的新技能哦～

我们先来看看单细胞测序（Single-cell sequencing）

普通测序所提取的RNA（或DNA）源于样本中的多个细胞，得到的RNA信息是混杂在一起的，所以没办法鉴别不同细胞间存在的异质性（Heterogeneity），而很多发育过程或者疾病发生等往往是与一些特定细胞的作用有关，这个时候普通测序就不能研究这些特定的单个细胞发挥的巨大作用；而单细胞测序则是针对单个细胞的基因组进行测序，能够更好地帮助我们认识细胞与细胞之间的差异。单细胞测序技术自2009年问世，2013年被Nature Methods评为年度技术以来，越来越多地被应用在科研领域：肿瘤异质性研究、个体发育、干细胞研究、新细胞与稀有细胞亚型的鉴定等。

新冠肺炎爆发至今，已经有多篇单细胞测序助力新冠肺炎致病机理研究和治疗方案探索的文章。同济大学左为团队利用单细胞测序技术对人体肺脏内每一个细胞的表达情况进行了分析，研究表明，ACE2受体的表达主要集中在肺内一小群II型肺泡上皮细胞(AT2)上¹；浙江大学郑敏团队等也利用单细胞测序技术分析了呼吸道不同位置组织中的ACE2 RNA表达谱，结果表明ACE2在鼻上皮细胞中也表达，说明鼻腔也可能是病毒感染侵袭的重要器官²。

在新冠治疗方案探索中，单细胞测序也贡献了巨大的力量：北京大学BIOPIC/ICG等单位用高通量单细胞测序分析新冠病毒康复者体内B细胞VDJ基因重排生成的抗体，找到了新冠肺炎多种全人源抗体³; 然后是上海大学等单位的研究表明MSCs移植治疗新冠肺炎具有安全性和有效性，能够缓解病人症状，改善肺部炎症。同时他们利用10X单细胞测序技术对移植的MSCs进行单细胞测序分析，发现MSCs呈ACE2或TMPRSS2阴性，不被COVID-19感染；MSCs高表达抗炎因子和营养因子，进一步证实MSCs的免疫调节功能；MSCs高表达SPA和SPC，提示MSCs极有可能分化成肺部AT2细胞；MSCs表达抗病毒通路的基因⁴。

以上提到的例子只是单细胞测序展现的迷人一角，别着急，小达君还有洪荒之力没有使出来呢：同时获得单细胞mRNA和表面抗原信息

随着单细胞RNA测序的发展，单纯的 mRNA 的信息对研究人员来说已经不能满足他们的需求，在2017年 Peterson,et. al ⁵ 及 Stoeckius, et. al ⁶  通过偶联在抗体上的 oligo 序列（标签抗体），独创性地利用 10X Genomics 平台获取细胞表面抗原的信息，并且是真正意义上的获取了同一个细胞的 mRNA 和蛋白信息。2019年，Nature Method将单细胞多模态组学（Single Cell Multimodal Omics）评选为年度技术，同时获得单细胞mRNA和表面抗原信息也是单细胞多模态组学的一种， 1+1>2 是这项技术最迷人的地方。

Biolegend利用这项技术研发的抗体上连接的这段oligo由3部分组成，第一部分是一段PCR handle序列，它是匹配二代测序平台的扩增模板；第二部分是一段Antibody Barcode，一段15nt的特异性序列，唯一barcode和唯一抗体克隆号对应；第三部分是捕获序列，与GEL beads或capture beads上的oligo序列互补配对，使得抗体上的oligo可以被beads所捕获。而TotalSeq™-A设计用于依赖poly-dT作为mRNA捕获的方法的单细胞测序平台，如10X Genomics；TotalSeq™-B是与10X Genomics公司最新Single Cell Gene Expression (3’ v3)相兼容，而TotalSeq™-C抗体是与10X Genomics公司的Single Cell ImmuneProfiling (5’)相兼容。

小达君感觉大家被这个超大的招砸的有点懵。来来来，小板凳准备好，小达君给大家扒一扒这种同时获得单细胞mRNA和表面抗原信息的新技术到底有哪些优势：

在单细胞RNA测序中，尽管有的细胞表达了相应的mRNA，但是无法被单细胞mRNA测序所检测到，但是假如加上标签抗体之后，可以识别细胞表面的蛋白，改善dropout现象⁶。

仅仅通过mRNA的数据将PBMC细胞进行聚类分析，发现其中某些转录本相似的群体之间，难以区分（图A）；加上抗体标签的信息之后，CD4⁺细胞和CD8⁺细胞之间的分群得到改善。并且CD4细胞亚群之间的区分度更高（图B）。

常规的多色流式细胞术，可以同时检测20+抗体，它的发展受限于不同荧光素之间的补偿；较新的技术，比如光谱流式及质谱流式，通过全光谱解析或者金属离子偶联代替荧光基团，可以同时检测细胞上30+甚至40+的指标，但是他们也受限于荧光素和金属离子的种类；但是TotalSeq™的抗体就不一样了， 由15个碱基组成的Antibody Barcode理论上的组合数远大于现有抗体的数。Stoeckius et al 在文章中使用了14个抗体的组合，Peterson et al在文章中使用了82个抗体，BioLegend在厂内做了单个细胞上220个抗体的组合实验！现在限制单细胞表面抗原检测的不再是荧光素的种类，而是现有抗体的种类！

TotalSeq™  Human TBNK Cocktail是BioLegend专门为单细胞测序设计的panel。这些冻干的抗体方便使用，且已经根据人PBMC预先优化并滴定浓度，并且按照1test/支进行包装，可以直接使用。

精彩回顾

• 新品丨TotalSeq™ B and C，我们不一样，不一样

• 一文盘点CITEseq（同步检测mRNA与表面抗原）最新文章发表

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参考文献

1. Yu Zhao, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCoV.BioRxiv.Jan.26,2020.

2. Chao Wu et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCoV, in the nasal tissue. medRxiv 2020.02.11.20022228.

3. https://biopic.pku.edu.cn/zxdt/501497.htm

4. Zikuan Leng, et al. Transplantation of ACE2- Mesenchymal Stem Cells Improves the Outcome of Patients with COVID-19 Pneumonia. Aging and disease, DOI: 10.14336/AD.2020.0228

5. Peterson VM, et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nat Biotechnol. 2017;35(10):936-939

6. Stoeckius M, et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 2017;14(9):865-868